Es el lugar en que el sustrato se une a la enzima y se realiza la reacción. Está formado en parte por el polipéptido y en parte por el grupo prostético o la coenzima. Además del sitio activo las enzimas suelen tener otros sitios distintos con características peculiares y específicas.
Como el sitio alostérico que es donde actúan los moduladores y que pueden ser uno o más. El modelo de llave y cerradura de Emily Fisher y que se manejó por mucho tiempo supone un sitio activo rígido y que se ha demostrado que no concuerda con los datos encontrados.
Koshland en 1959 postuló la teoría del acoplamiento inducido, el cual sustenta que la combinación de la enzima con “ligandos” pequeños produce cambios de conformación en la proteína. Cuando el ligando corresponde al sustrato, estos cambios estructurales conducen a la orientación y a la ubicación adecuada de los grupos catalíticos de la proteína y se genera el sitio activo. Una vez terminada la reacción los productos se disocian de la enzima y ésta regresa a su estado original.
Esta teoría se ha visto reforzada con lo observado por Monod y colaboradores en relación con la regulación alostérica de las enzimas. En donde el termino alosterismo fue originalmente usado para explicar la inhibición competitiva causada por sustancias estructuralmente disímiles al sustrato y que implicaba la unión de dicha sustancia en un sitio que no es el activo y que a la distancia causaba una modificación en la conformación alterando la unión con el sustrato.