Contenido: Introducción. Métodos más empleados en la determinación de proteínas. Desnaturalización de las proteínas.
Introducción
Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas, todos ellos basados en alguna de sus propiedades típicas, como pueden ser los patrones de adsorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos, la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, etc.
En el bloque siguiente se muestra un resumen de los más conocidos. Se determina el Principio, Ventajas y Limitaciones; de acuerdo con el alimento de que se trate, la exactitud requerida, la disponibilidad de equipo, etc. se utilizará alguno de estos métodos.
Métodos más empleados en la determinación de proteínas
– Absorción en el ultravioleta (280 nm)
Principio
La mayoría de las proteínas absorben en el UV a 280 nm. Debido básicamente a grupos cromóforos de tirosina y triptofano. Si se considera que la cantidad de estos dos aminoácidos es siempre constante la absorbancia debe ser proporcional a la concentración de proteína.
Ventajas
Es el método más rápido: requiere de muy poca cantidad de proteína. El sulfato de amonio no interfiere mientras que en la mayoría de los métodos si existe interferencia. La muestra no se destruye y puede ser usada en otros análisis.
Limitaciones
Se puede hacer una corrección por presencia de ácidos nucleicos ya que estos tienen absorción máxima a 260 nm. Si se conoce la relación de absorción de la proteína a 280/260 nm es fácil distinguir la interferencia de ácidos nucleicos. Varía la cantidad de aromáticos entre proteínas.
– Biuret
Principio
Las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo púrpura-violeta con sales de cobre en soluciones alcalinas. Es posible que el color se desarrolle por la formación de un ión coordinado tetracúprico con dos grupos -CO-NHadyacentes.
Ventajas
Es el método más simple para medir la proteína total. Muy pocas interferencias de otros compuestos en el desarrollo del color.
Limitaciones
Se requiere de 20-40 mg de proteína. Existen varios pigmentos que absorben a 540mm de longitud de onda. La presencia de NH interfiere con la reacción. El color es diferente para cada proteína. Interfieren lípidos e hidratos de carbono por formación de complejos con el ion coordinado.
– Lowry
Principio
Se basa en el desarrollo de un color azul debido a: 1) Reacción de Biuret. 2) Reducción del reactivo de fosfomolibdeno-volframato por aminoácidos como tirosima y triptófano presentes en las proteínas.
Este método ha sido modificado muchas veces. La absorbencia se mide a 750 nm (alta sensibilidad o a 500 nm (baja sensibilidad) para proteinas concentradas. Se requiere de una curva patrón que es recomendable hacer con la misma proteína. La sensibilidad va desde 0.2 ?g hasta 300 ?g.
Ventajas
Es el método más sensible 100 veces más sensible que el Biuret. Más omenos rápido(1 h)
Limitaciones
Requiere de muchos cuidados en la estandarización ya que 1) la intensidad del color varía entre proteínas. 2) El color no siempre es proporcional a la concentración.
Existe interferencia de lípidos, sacarosa, amortiguadores del PH, monosacáridos y hexosaminas ya que reaccionan con los reactivos de Lowry. Los sulfatos de amonio, los sulfhidrilos y los fosfatos también interfieren en la determinación.
– Turbidimétrico
Principio
Las proteínas se pueden precipitar con ácido tricloroacético, ácido sulfosalicílico o ferrocianuro de potasio en ácido acético. Se produce turbidez que puede ser estandarizada a una temperatura, concentración y tiempo de reacción para medirse a 600 nm. Se requiere de curva estándar. El intervalo recomendado va de 0.5 a 1.5 mg de proteína.
Ventajas
Es el método más rápido (10 a 15 min)
Limitaciones
Tiene muchas limitaciones ya que no todas las proteínas precipitan en la misma forma en presencia de ácidos. Otras sustancias como los ácidos nucleicos también precipitan en presencia de ácidos.
– Kjeldahl
Principio
Determina nitrógeno total tanto orgánico (nitrógeno amino y amido) como nitrógeno no proteico (urea, aminoácidos, etc.). El método consiste en la digestión de la muestra con H2SO4, y la formación de NH2OH que es recibido en ácido para finalmente titularlo con álcali de una concentración conocida.
Ventajas
Es el método más común y por lo tanto permite comparar fácilmente resultados con otros laboratorios. Determina todo el contenido de nitrógeno del alimento. El nitrógeno no proteico puede ser analizado después de precipitar la proteína con ácido tricloroacético.
Limitaciones
Puede haber pérdidas de nitrógeno debido a la temperatura de digestión y al catalizador. El contenido de nitrógeno en la proteína puede variar considerablemente y por lo tanto el factor usado para convertir nitrógeno a proteína.
El nitrógeno no proteico se debe tomar en cuenta ya que éste se mide junto con el proteico. Se usan reactivos y condiciones un tanto peligrosas. El proceso es largo.
– Dumas
Principio
Mide nitrógeno total después de la combustión de la muestra (700-900°C). La medición de nitrógeno elemental desprendido se hace volumétricamente en un nitrómetro.
Ventajas
Se pueden hacer análisis hasta en 10 min. con los equipos automatizados que existen en el mercado.
Limitaciones
Se requiere de equipo muy costoso. La presencia de nitrógeno no proteico interfiere en las determinaciones.
Desnaturalización de las proteínas
El calor, los ácidos y las bases fuertes, los disolventes tales como el alcohol etílico, las soluciones concentradas de algunas sales, la urea y algunas sustancias fenólicas, generalmente provocan cambios profundos en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas solubles.
Estos cambios incluyen la pérdida de la solubilidad (coagulación), la formación de geles irreversibles, la exposición de grupos reactivos tales como los sulfhidrilos, una mayor susceptibilidad frente a a hidrólisis enzimática (y, por tanto, una mejor digestibilidad), alteración de los patrones de difracción de rayos X y rotación óptica. Los cambios son a menudo, aunque no siempre, prácticamente irreversibles. Se acostumbra agrupar todos estos cambios bajo un término: desnaturalización.
A nivel molecular, se define la desnaturalización como toda modificación en la conformación de la proteína. La desnaturalización, por lo tanto, implica una destrucción en mayor o menor grado de las uniones de valencia secundarias responsables de la conformación propia de la proteína original, aunque sin que se produzca rupturas de uniones covalentes o proteólisis.
Muy a menudo, el resultado global de la desnaturalización de una proteína globular es el despliegue de la cadena polipeptídica y su transformación en un polímero plegado al azar.
Esta transición explica la formación de geles, la coagulación, el aumento de reactividad y la susceptibilidad a la acción enzimática. Colvin describe a la desnaturalización como una transición “orden desorden”. (El término prácticamente irreversible equivale a decir que el proceso de renaturalización es mucho más lento que el de desnaturalización.) Karlsow compara la desnaturalización de las proteínas con la fusión de una sustancia cristalina.
Al igual que se va deshaciendo la estructura ordenada del cristal durante la fusión, la proteína original va perdiendo el alto grado de orden de su conformación durante el curso de la desnaturalización.
La desnaturalización de las proteínas es un proceso de importancia primordial en la tecnología de alimentos. La inactivación térmica de las enzimas, se debe en gran parte a la desnaturalización.
La desnaturalización de las proteínas puede contribuir tanto a la textura como al sabor de muchos alimentos. Es así que la exposición de los grupos —SH contribuye marcadamente al sabor propio de los alimentos ricos en proteínas sometidos a cocción, tales como los huevos y la leche.
En este proceso se pierden las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria sin que haya una hidrólisis del enlace peptídico. En el caso de que se rompan los enlaces “disulfuro” que estabilizan la estructura terciaria es difícil que regrese a su estado natural, aunque como en el caso de algunas enzimas la reactivación o renaturalización es posible.
Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización, estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración.
Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.
En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.
Fuente: Apuntes de la materia bioquímica general / unideg