Los ácidos grasos se activan y se oxidan en las mitocondrias, donde penetran mediante un proceso de transporte. La activación corre a cargo de la CoA, que se une al grupo carboxilo del ácido graso.
A continuación se producen dos reacciones de deshidrogenación que dan lugar a la formación de un compuesto cetónico. La fijación de una nueva molécula de CoA a dicho compuesto provoca la escisión en acetil-CoA y un ácido graso activado con dos carbonos menos que el inicial, el cual repite el mismo proceso sucesivas veces liberando en cada una de ellas una molécula de acetil-CoA que se incorpora al ciclo del ácido cítrico.
Los hidrogeniones desprendidos son recogidos por la cadena de transporte electrónico para activar el oxígeno y formar agua. Acoplada al flujo de electrones se halla la fosforilación oxidativa del ADP a ATP, de modo que la energía liberada en ambas fases de la oxidación del ácido graso se conserva en forma de ATP.